1. 種屬來源要匹配：根據所用一抗選定二抗。一般來說，如果一抗是小鼠原性，二抗應選擇兔/山羊或其它種屬抗小鼠的抗體。目前，美國Vector公司和Zymed公司都有開發的用小鼠抗體檢測小鼠組織的試劑盒，即一抗來源于小鼠，該試劑盒采用了通用非特異性封閉液和封閉內源性小鼠Ig的封閉液，可以得到清晰的染色背景。
2. 注意抗體同種型和亞型：確定一抗同種型和亞型后，可以選擇抗一抗來源種屬廣譜Ig或針對一抗亞型的二抗。如一抗是小鼠IgG1, 可以選用山羊抗小鼠的Ig或IgG1的二抗。
3. 正確使用：也需要重新選擇稀釋比例。一般從供應商提供稀釋比例的1/10稀釋度始，作5倍比稀釋。
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