免疫組化染色沒有出現(xiàn)預(yù)期結(jié)果時，應(yīng)系統(tǒng)地查找原因，而每一次只能排除一種可能的原因。
對照/標(biāo)本無染色
① 確認(rèn)是否忽略了應(yīng)該加的某種試劑，包括一抗、二抗、三抗及底物等。
② 確認(rèn)所有的試劑是否按正確的順序加入，是否孵育了足夠的時間。
③ 對照抗體的標(biāo)簽確認(rèn)是否使用了正確的抗體，以及所用的檢測系統(tǒng)是否和一抗匹配，這一點是非常重要的。比如，如果一抗是兔來源的抗體，二抗一定要用抗兔的二抗來匹配；或一抗是小鼠的IgM一抗，二抗必須是山羊/兔抗小鼠的IgM（不是IgG）二抗。
④ 檢查抗體所使用的稀釋度及稀釋溶液。
⑤ 檢查抗體的有效期和保存條件，尤其是標(biāo)記了酶或熒光素的抗體，現(xiàn)在大多數(shù)試劑公司的抗體均要求在4~8℃條件下保存，應(yīng)避免反復(fù)凍融，試劑保存時一定要避免與揮發(fā)性有機溶劑同放一室，以免降低抗體的效價。
⑥ 檢查標(biāo)本的儲存條件，用已知陽性的標(biāo)本來同時做陽性對照。
⑦ 檢查色原/底物溶液，zui簡單的檢測方法是將一滴標(biāo)記有酶的抗體加入到制備好的底物溶液中，如果底物發(fā)生預(yù)期的顏色變化，則可排除底物的因素。需要注意的是，有些底物在制成工作液后應(yīng)在一定時間內(nèi)用完，否則會失效。
⑧ 檢查沖洗液是否和反應(yīng)試劑匹配，溶液的pH值很重要，與過氧化物酶底物匹配的溶液中不應(yīng)含有疊氮鈉。
⑨ 檢查復(fù)染劑和封片劑是否和所使用的色原匹配。
弱陽性
如果陰性對照沒有染色而陽性對照標(biāo)本弱陽性，除了考慮上述因素外，還應(yīng)考慮：
① 標(biāo)本的固定方式，不當(dāng)?shù)墓潭ǚ绞交蚬潭〞r溫度過高，都會影響到所檢測的抗原的數(shù)量和質(zhì)量。
② 不適當(dāng)?shù)目乖迯?fù)方式，由于石蠟切片在制作的過程中固定劑對抗原的封閉作用，必須用抗原熱修復(fù)或酶消化或兩種同時使用的抗原雙暴露法，至于使用哪一種方法，應(yīng)參照生產(chǎn)廠家的說明，同時結(jié)合標(biāo)本的具體情況而定。
③ 抗體的稀釋度是否過高或者孵育的溫度/時間是否正確。一般試劑生產(chǎn)廠家都會對試劑給出一定的使用范圍，但是由于使用者的標(biāo)本來自各種組織，處理過程也不盡相同，所以應(yīng)參照使用范圍，對所使用的一抗進行梯度測試，找出的使用濃度。
④ 切片上了過多的沖洗液，當(dāng)抗體加至切片上時，等于人為地對抗體進行了進一步的稀釋。
⑤ 孵育時切片是否放置水平，否則會導(dǎo)致抗體流失。如果陰性對照沒有反應(yīng)，陽性對照反應(yīng)良好，而標(biāo)本弱陽性，則可能是由于陽性對照不是同一種組織、或固定方式不同等原因所致。
免疫組化和western blot驗證蛋白質(zhì)上有什么區(qū)別？
要驗證某個細(xì)胞上有無該蛋白的存在，需要做免疫組化和western blot試驗嗎？做這兩個試驗時的一抗和二抗可以共用嗎？
① 免疫組化可以用來進行定位，但是不能定量，而且有時會有假陽性，不易與背景區(qū)分；Western blot可以特異性檢測某個蛋白質(zhì)分子，進行定量，但是不能定位。
② 兩種實驗的一抗有時候不能通用，公司的產(chǎn)品說明一般都會說明可以進行什么實驗，在免疫組化時，是否適合石蠟切片或者冰凍切片。
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