以抗體包被的夾心法為例，加入板孔中的標本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結合的機會，只有zui貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。ELISA試劑盒37℃是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數抗原抗體結合的合適溫度．
在建立ELISA方法作反應動力學研究時，實驗表明，兩次抗原抗體反應一般在37℃經1～2小時，產物的天生可達。ELISA試劑盒濕盒應先放在保溫箱中預溫至劃定的溫度，特別是在氣溫較低的時候更應如斯。抗原抗體反應的完成需要有一定的溫度和時間，這一保溫過程稱為溫育，有人稱之為孵育，在ELISA試劑盒中似不恰當。這就是為什么ELISA反應老是需要一定時間的溫育。為加速反應，可進步反應的溫度，有些試驗在43℃進行，但不宜采用更高的溫度。ELISA屬固相免疫測定，抗原、抗體的結合只在固相表面上發生。
溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫順4℃等。室溫溫育時要平置于操縱臺上即可。這是一個逐步平衡的過程，因此需經擴散才能達到反應的終點。一般有兩次抗原抗體反應，即加標本和加酶結合物后。不管是水浴仍是濕盒溫育，反應板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。
保溫的方式除有的ELISA儀器附有特制的電熱塊外，一般均采用水浴，可將ELISA試劑盒板置于水浴箱中，ELISA板底應貼著水面，使溫度迅速平衡。為避免蒸發，板上應加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜籠蓋板孔，此時可讓反應板漂浮在水面上。ELISA試劑盒若用保溫箱，應放在濕盒內，濕盒要選用傳熱性良好的材料如金屬等，在盒底墊濕的紗布，zui后將ELISA板放在濕紗布上。應留意溫育的溫度和時間應按劃定力求正確。抗原抗體反應4℃更為*，在放射免疫測定中多使反應在冰箱中過夜，以形成zui多的沉淀。室溫溫育的反應，操縱時的室溫應嚴格限制在劃定的范圍內，尺度室溫溫度是指20～25℃，但詳細操縱時可根據仿單的要求控制溫育。在其后加入的酶標記抗體與固相抗原的結合也同樣如斯。為保證這一點，一個人操縱時，一次不宜多于兩塊板同時測定.。但因所需時間太長，一般不予采用。
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